高通量筛选系统
ESETEC®表达系统的众多菌株不久前还要靠手工制备和培养，现在却由多个机器人负责，并以微升及毫升为单位进行筛选。
高速筛选优质菌株
瓦克生物技术公司拥有多种大肠杆菌菌株，以按客户订单生产生物制剂。但哪种细胞系与哪些目标活性成分相匹配？这个选择和操作过程通常比较困难，现在终于有了筛选系统的辅助。
“我们必须同时测试约1000个细胞系，并进行必要的检查，如果没有自动化辅助，就无法完成这项工作。”
Philipp Schmid博士，瓦克生物技术公司工艺开发高级科学家
Aurelia Stangl博士在瓦克研发部门——电化学工业联盟生物技术部工作，她与团队在初步筛选中测试了6种ESETEC®宿主菌株，每种菌株与50种不同的表达质粒相结合。
生物制剂是在活细胞，例如极其常见的大肠杆菌中产出的。在自然界，许多温血动物，包括人类的肠道中都有大肠杆菌。然而，虽都称为大肠杆菌，但也不完全相同，它们有许多不同种类的菌株，与生产所需的不同表达质粒相结合，可组成大量可能的细胞系，而且也不是任何一种细胞系就能用来生产任何一种生物制剂。因此，每次开始生产前，都要弄清一个问题：哪种细胞系能够与目标活性成分对应？
瓦克集团子公司——瓦克生物技术公司作为生物制药合同生产商，也使用一套特殊的表达及分泌系统生产蛋白质基活性成分。这个系统名为ESETEC®，在K12大肠杆菌菌株和一系列高效率的表达质粒基础上开发而成，已获得专利。ESETEC®技术不断得到优化，现已形成一个丰富的元件库可供使用，其中包括多种ESETEC®宿主菌株及相应的表达质粒。在瓦克生物技术公司负责细胞系开发的Marcel Thön博士说：“找到能够用来按所需质量和数量生产活性成分的最佳细胞系，这有点像大海捞针。”
此前，开发细胞系的员工在筛选时完全凭经验，根据目标蛋白的需要，排除不适用的ESETEC®宿主菌株和表达质粒，让其余的进入下一步检测：在摇瓶中以毫升为单位，测试约10至20种ESETEC®宿主菌株与表达质粒组合。
300种细胞系通常需要经过3次筛选，然后才能确定哪种组合最适合生产哪种药用蛋白质。
系统使用的每个机器人都是量身定制的“孤品”，其中一些组件是专为高通量筛选设计的。
为优化筛选过程，瓦克集团直属研发部门——电化学工业联盟开发了一种多级系统高通量筛选（High-Throughput-Screening/HTS）系统，用以自动选择合适的细胞系。
Philipp Schmid博士在电化学工业联盟与一个跨学科团队一起创建了这个系统。他介绍说：“我们2019年底开始研发HTS，现在，瓦克生物技术公司已经可以用它来为客户进行订单生产了。”参加项目的有来自集团直属研发部门的生物技术、发酵和分析实验室专家小组，以及瓦克博格豪森生产基地的高级分析工作小组的员工。瓦克生物技术公司也让未来的客户参与到了项目中。
这个系统先会产出多达300种不同的细胞系，这时，每6种ESETEC®宿主菌株会与50种不同的表达质粒相结合。“每个用不同ESETEC®宿主菌株生成的细胞系，还另含一个带客户目标蛋白编码的表达质粒。由于每个质粒又具有不同的遗传特性，所以，我们就有大量的各不相同的组合可能。”Schmid博士介绍说。
K12大肠杆菌菌株是开发ESETEC®表达系统的基础。
自动化分析
实现高通量，同样需要新的解决方案：制备细胞系需要的空间被减少到之前的1/12。
首先，要检查300个组合各自的效率如何。为提高可比准确度，每个组合必须重复测试3次。“我们必须同时测试约1000个细胞系，并进行必要的检查，如果没有自动化辅助，就无法完成这项工作，因为耗费的时间太多。”Schmid先生说。生产细胞系，以及首次以亚毫升（sub-mililiter scale）级别进行初步筛查的工作均由机器人自动完成，而不再像以前那样手工制备和培养。对生产率的分析工作也借助专门的分析方法，即，RapidFire®质谱法自动完成，测试每个样品仅需几秒钟。
初步筛查后，第二步工作是在微型生物反应器中为8至16个最具潜力的细胞系模拟后续发酵环境。这时，必须精确控制氧气、pH值、温度和营养物质的供应，并确定这些筛选出的细胞系中，哪些在受控培养条件下具备最出色的产品特性。这道工序也以毫升为单位自动化进行。
“我们已经完成了概念验证阶段的工作，客户们现在可以‘享用’这套系统了。”
Marcel Thön博士，瓦克生物技术公司生物工艺开发高级专家在实验室完成最后一道工序
一旦为机器人配备好所需耗材，就只需在指定的地方进行人工操作——工作量减少，可为创新提供更多空间。
系统一旦识别出最佳生产者细胞系，最后一步工作就是实验室常规发酵，以5升规模，再次检测剩余的4至8个最具潜力的候选者的生产率。最终，一个候选者在质量和数量上胜出。
这套系统也已在实践中展示了功力。Schmid先生介绍说：“我们在多个系列测试中验证了这种自动识别最佳生产者的方法确实有效。”例如，它为一种瓦克多年来作为研究用模型蛋白的抗体片段确定了生产特性更佳的细胞系（见图解）。
它还为瓦克生物技术公司数年来为客户生产的一种蛋白质找到了新的产率更高的细胞系，使产物滴定度提高约40%。
“我们已经完成了概念验证（POC）阶段的工作，客户们现在可以‘享用’这套系统了。对他们而言，高通量筛选意味着：由于通量显著提高，他们为相应目标蛋白质找到ESETEC®宿主菌株与表达质粒真正的最佳组合的机会大增，在寻找高效产品时，损失的时间也更少。”Thön先生介绍说。
瓦克通过整合新的ESETEC®宿主菌株及表达质粒等手段，不断地对高通量筛查系统进行后续研发，并计划将系统用于大肠杆菌FOLDTEC®细胞系筛选；后者是瓦克受专利保护的蛋白质复性技术。
以抗体片段为目标蛋白质的高通量筛选（HTS）运行结果
首先，以亚毫升为单位对每个自动生成的细胞系进行培养，并用RapidFire®质谱法分析生产率。
挑选出8个最佳候选产物，在微型生物反应器中进行受控培养，最后，通过实验室发酵测试剩余最佳候选产物的生产率。
无论是在微型生物反应器中受控培养，还是最后的实验室发酵，被选中的ESETEC® #2和#4细胞系表现出比对照细胞系更高的产率；瓦克多年来以知识积累的方法对后者进行优化。
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